Эпидемиология, Беляков В.Д., Яфаев P.X., 1989
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Глава 7

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Важная задача эпидемиологии состоит в выявлении скрытых механизмов развития эпидемий и их подготовки. Решение этой задачи становится возможным благодаря современным методам анализа. Использование молекулярных методов в эпидемиологии и оценка результатов на новой теоретической основе составляет предмет специальной отрасли знания — молекулярной эпидемиологии.

Молекулярная эпидемиология изучает молекулярные механизмы популяционных перестроек, т. е. предвестники эпидемиологических проявлений. Кроме того, в задачи молекулярной эпидемиологии входит разработка методов слежения за распространением возбудителя.

Возникновению нового направления в эпидемиологии способствовал ряд обстоятельств. Во-первых, возрастание роли массовых обследований в профилактике заболеваний. Во-вторых, бурное развитие молекулярной биологии и генетики, сделавшее возможным непосредственное изучение распределения генов в популяциях, а также фенотипических признаков. В-третьих, становление новой теоретической концепции эпидемиологии, предполагающей учет внутренних механизмов развития эпидемического процесса.

Современные теоретические обобщения эпидемиологии позволяют предсказывать и анализировать скрытые явления, не подлежащие непосредственной регистрации. Полученные выводы нуждаются в строгом лабораторном подтверждении. Молекулярно-эпидемиологический анализ в совокупности с углубленным анализом заболеваемости и составляет ядро эпидемиологического метода исследования.

Молекулярная эпидемиология тесно связана с молекулярной генетикой патогенных микроорганизмов. В настоящее время установлены два типа изменчивости микробных популяций: внутриклональная и межклональная. Межклональная изменчивость основывается на размножении исходно неоднородной популяции и поддерживается генетическим обменом. Внутриклональная изменчивость обеспечивается процессами генерации неоднородности за счет генетических перегруппировок.

В определенных условиях активизируются наиболее опасные «линии» возбудителей, что определяет последующую неблагоприятную эпидемическую обстановку и циклические подъемы заболеваемости.

Адаптационная изменчивость клонов возможна лишь в определенных пределах, не нарушающих сбалансированность генотипа. Направленность изменчивости связана с распределением мигрирующих элементов и других регуляторных структур в различных участках генома. В пределах биологического вида имеются адаптирующиеся «линии» микроорганизмов, представленные совокупностью «родственных» клонов.

Исследование межклональной изменчивости важно для понимания механизма ранних стадий развития эпидемического процесса. Эффективно циркулирующие микроорганизмы могут приобретать дополнительные гены, например антигенности, токсигенности, за счет процессов генетического обмена. Рекомбинация циркулирующих вирусов гриппа А человека с персистентными антигенными анахронизмами способствует образованию эпидемических вариантов вируса.

У бактериальных клеток установлена мобилизация «резерва генов», т. е. внутриклональная изменчивость. Так, в геноме Neisseria gonorrhoeae содержится несколько нефункционирующих копий гена пилина — белка, ответственного за адгезию. Рекомбинация между этими генами и основным дефектным геном, находящимся в сайте экспрессии, приводит к восстановлению полноценного гена, образующего функционально активный пилин. Этот механизм, как и рекомбинация у вирусов, способствует одновременно приобретению вирулентности и антигенной изменчивости.

Адаптация микроорганизмов основывается на точечных и блочных перестройках в определенных локусах генетического аппарата.

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Методический арсенал любой науки предполагает непосредственное изучение явлений, их моделирование и прицельное конструирование. К специальным методам, применяемым в эпидемиологии, относятся следующие.

1.    Микробиологическое и иммунологическое слежение за развитием эпидемического процесса.

2.    Экспериментальное моделирование элементов эпидемического процесса.

3.    Математическое моделирование популяционной изменчивости и эпидемических ситуаций.

4.    Конструирование вакцинных штаммов с заданными свойствами и направленное создание других противоэпидемических средств.

Все эти методы различны по содержанию, но имеют общую молекулярно-биологическую основу. Большой информативностью для практики отличаются методы молекулярных исследований, с помощью которых изучают выделенные штаммы возбудителей.

Эти методы делятся на молекулярно-генетические и молекулярно-биологические. Молекулярно-генетические методы направлены на изучение генома возбудителей, а молекулярно-биологические — на выявление фенотипических признаков. Различают скрининг-методы и методы углубленных исследований. При помощи первых можно проанализировать большое количество изолятов, а последних — лишь ограниченное их число в связи с большей детализацией и сложностью исследования. Методы молекулярного анализа можно группировать в соответствии с принципом, положенным в основу выявления конечного результата (использование радиоактивных изотопов, иммуноферментной индикации и др.).

С помощью скрининг-методов можно проводить массовые обследования с изучением изолятов возбудителей. В последующем отдельные варианты отбираются для углубленного анализа с целью выявления генетических перегруппировок.

Прогресс современной молекулярной эпидемиологии связан с появлением быстрых и качественных методов скрининга внехромосомных элементов (плазмид) у бактерий (лизис, очистка ДНК плазмид, электрофорез в агарозном геле).

В настоящее время плазмиды (дополнительные кольцевые молекулы ДНК) обнаружены у значительного количества патогенных и условно-патогенных видов микроорганизмов. Плазмиды с неизвестной функцией (критические) используются для маркирования. Плазмиды большого молекулярного веса (шигелл, иерсиний, энтеропатогедных кишечных палочек) связаны с вирулентностью. Их выявление важно для анализа изменчивости возбудителей.

Возникновение метода переноса колоний непосредственно с чашки на нитро- или диазобумагу позволяет осуществлять скрининг даже без выделения отдельных культур. Можно определять присутствие у составляющих колонию микроорганизмов гомологичных последователей ДНК при помощи молекулярных зондов (блот-гибридизация колоний) или способность их синтезировать определенные продукты при помощи иммунологических зондов (имму-ноблоттинг колоний).

В настоящее время возможно внедрение в эпидемиологическую практику ДНК-зондов на присутствие генов токсигенности: Corynebacterium diphteriae, Vibrio cholerae, энтеротоксигенных E. coli, скарлатинозных Streptococcus pyogenes. Имеются зонды для выявления генов адгезии Е. coli, инвазии возбудителей родов Escherichia, Yersinia, Shigella и т. д. Создана категория зондов, основанная на генах рибосомной РНК, позволяющих идентифицировать виды, роды и более крупные таксономические группы микроорганизмов.

Методы углубленных молекулярно-генетических исследований также имеют высокую молекулярно-эпидемиологическую значимость. Они способствуют выяснению молекулярных механизмов развития эпидемического процесса. Следует назвать анализ фрагментов нуклеиновых кислот, полученных ферментативным расщеплением (рестрикционный анализ ДНК бактерий, о лигонуклеотидное картирование РНК-генома вирусов), и определение нуклеотидной последовательности наиболее важных фрагментов генетического аппарата. В настоящее время метод секвенирования эффективно применяется для изучения изменчивости вирусов.

Большая роль молекулярно-эпидемиологических исследований все больше раскрывается с течением времени. Они вносят решающий вклад в понимание внутренних механизмов развития эпидемического процесса.